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本文作者：吳錫1,2許麗英1張雪霞1宋雨1,2王新1賈永鋒1作者單位：1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2.中國科學(xué)院研究生院

砷污染是一個(gè)全球性的環(huán)境問題［1～3］，由于自然因素和人為因素的影響，土壤、地下水和地表水等環(huán)境的砷污染嚴(yán)重危害人類的健康和生態(tài)環(huán)境［2～4］．據(jù)調(diào)查，我國重金屬污染的耕地面積達(dá)2000萬hm2，約占我國耕地總面積的1/5，許多城市和工礦區(qū)的土壤都受到不同程度的砷污染［5］，對(duì)我國的食品安全、環(huán)境質(zhì)量和人們的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［6～11］．砷的毒性與生物有效性在很大程度上由砷的賦存形態(tài)決定，而砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化直接關(guān)系到砷的環(huán)境行為及其環(huán)境效應(yīng)．通常土壤中的砷主要包括As(Ⅴ)和As(Ⅲ)這2種形態(tài)，二者可因環(huán)境條件改變或在環(huán)境微生物作用下相互轉(zhuǎn)化［12，13］．土壤微生物對(duì)砷的還原作用可以直接或間接地影響其賦存形態(tài)與環(huán)境行為．在土壤中砷大部分與鐵、錳、鋁氧化物礦物、黏土礦物及腐殖質(zhì)等結(jié)合，不同形態(tài)的砷與礦物的親和力有所區(qū)別，當(dāng)五價(jià)砷被還原為三價(jià)砷后，土壤礦物對(duì)其吸持能力明顯降低，可引起砷的活化和釋放［14～16］．另一方面礦物中鐵的氧化物或氫氧化物礦物是固定砷最重要的基質(zhì)，微生物對(duì)鐵的形態(tài)轉(zhuǎn)化同樣是影響砷的形態(tài)與環(huán)境行為的關(guān)鍵因素．國內(nèi)外已有大量研究證實(shí)微生物對(duì)砷和鐵的還原作用強(qiáng)烈地影響土壤中砷的賦存形態(tài)與環(huán)境行為．例如，Vaxevanidou［17］和Wang［18］等發(fā)現(xiàn)土壤中砷的環(huán)境行為是由微生物對(duì)鐵和砷的還原作用共同調(diào)控，微生物引起的鐵的還原性溶解驅(qū)動(dòng)了砷的釋放行為．在微生物對(duì)砷的活化與釋放過程中，硫酸鹽還原過程是調(diào)控砷的另一重要因素，硫酸鹽還原產(chǎn)物H2S可直接或間接地影響砷的環(huán)境行為及穩(wěn)定性．一方面，在溶解態(tài)硫離子與土壤溶液中亞鐵離子沉淀的過程中，游離的砷可以被硫化亞鐵吸附或共沉淀;另一方面，水相中的H2S也可以與釋放的亞砷酸鹽反應(yīng)沉淀為硫化砷．因此當(dāng)微生物作用下土壤中的砷、鐵、硫同時(shí)被還原時(shí)，砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化與環(huán)境行為將受到多種物理化學(xué)和生物因素的控制，其環(huán)境行為機(jī)制也更加復(fù)雜．盡管國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)上述砷的地球化學(xué)循環(huán)的一般性機(jī)制和一些砷污染土壤開展了大量研究，并取得了很多重要成果［14～21］，但對(duì)于土壤中多元素共同調(diào)控下砷的環(huán)境行為及其形態(tài)轉(zhuǎn)化的微生物學(xué)與化學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究．本研究利用清潔土壤負(fù)載低劑量砷來模擬砷污染土壤，開展缺氧條件下土壤微生物作用對(duì)砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化與環(huán)境行為的影響，并探討砷釋放與固定的機(jī)制，旨在為評(píng)價(jià)砷土壤的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及建立污染修復(fù)方法提供依據(jù)．

1材料與方法

1.1土壤砷的負(fù)載

土壤樣品采自沈陽張士污灌區(qū)，0～100cm深，樣品每20cm為一層，分層裝入自封袋，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室－4℃冰箱冷凍．土壤消解后測(cè)定其中主要元素，如表1所示．其中砷的本底值為10mg•kg－1．采用1∶5的固液比進(jìn)行砷的負(fù)載(6.6mg•L－1的Na3AsO4溶液砷酸鈉溶液)，35℃，170r•min－1，避光，平衡24h．4000r•min－1離心10min，傾出上清，并用蒸餾水振蕩離心洗滌2次固體，測(cè)液相砷的殘留濃度，保留固體．負(fù)載后，土壤體系砷含量為40mg•kg－1.

1.2細(xì)菌的富集培養(yǎng)

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MSM，g•L－1):KH2PO40.14，NH4Cl0.25，KCl0.5，CaCl2•2H2O0.13，NaCl1.0，MgCl2•6H2O0.62，酵母提取物0.5，乳酸鈉2mL•L－1，外加硫源無水Na2SO410mmol•L－1，用1mol•L－1NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2．向載砷土壤中加入培養(yǎng)基，以1∶20的固液比，在35℃下170r•min－1恒溫振蕩器中避光培養(yǎng)8d．培養(yǎng)基采用無氧水配制，配制過程氮?dú)獗Ｗo(hù)，將培養(yǎng)基在厭氧手套箱中加入載砷土壤，于厭氧瓶中培養(yǎng)，以保證厭氧條件．用高壓滅菌鍋將土壤滅菌，作為對(duì)照組．非生物對(duì)照組實(shí)驗(yàn)的固液比、溫度等所有培養(yǎng)條件與生物培養(yǎng)組相同．

1.3分析方法

為避免樣品氧化，取樣與樣品處理在厭氧手套箱中進(jìn)行．樣品搖勻后取5mL培養(yǎng)液用0.45μm的濾膜過濾，濾液用于分析溶解態(tài)的Fe(Ⅱ)、Fe(T)(總鐵)、As(Ⅲ)和As(T)(總砷)的濃度．濾后固體用1mol•L－1HCl170r•min－1振蕩提取2h，4000r•min－1離心10min，上清液用于分析HCl提取態(tài)的Fe(Ⅱ)、Fe(T)(總鐵)、As(Ⅲ)和As(T)(總砷)的含量．另取土壤培養(yǎng)液5mL，加入5mL6mol•L－1HCl，170r•min－1提取5d，分析不同層土壤酸揮發(fā)態(tài)的S(即AVS)［23］．其中Fe(Ⅱ)和AVS立即進(jìn)行厭氧顯色并測(cè)定，而用于測(cè)定As(Ⅲ)的樣品用0.4mol•L－1的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.5)1∶1稀釋后在冰箱中保存48h內(nèi)測(cè)定．砷的形態(tài)測(cè)定［22］:As(Ⅲ)和As(T)濃度測(cè)定采用原子熒光光譜儀(AFS-2202，北京海光公司)進(jìn)行．其中As(Ⅲ)樣品先用0.4mol•L－1的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.5)作為樣品稀釋液和載液;As(T)的樣品中加入10%體積的預(yù)還原劑(含5%硫脲和5%抗壞血酸的混合溶液)，用5%HCl定容，反應(yīng)數(shù)小時(shí)后用原子熒光光譜儀測(cè)定As(T)．As(T)與As(Ⅲ)的差值即為體系中As(Ⅴ)的濃度．總鐵Fe(T)采用原子吸收光譜法分析［22］，亞鐵離子采用鄰菲啰啉分光光度法［22］，S2－離子采用亞甲基藍(lán)比色法測(cè)定［23］．

2結(jié)果與討論

2.1微生物作用下砷的釋放

在微生物作用下無外加硫的培養(yǎng)體系中各層土壤均見明顯的砷還原與釋放，但不同深度土壤砷的釋放程度有所不同，如圖1．20～40cm深度土壤砷的釋放量明顯高于其它層土壤，As(Ⅲ)和As(T)分別達(dá)到892.8μg•L－1和1240.6μg•L－1，與對(duì)照組相比，分別增加了856.7μg•L－1和995.2μg•L－1，在不同深度土壤的培養(yǎng)體系，液相中超過70%的砷是以As(Ⅲ)形式存在，非生物對(duì)照中幾乎沒有亞砷酸鹽．可見是微生物的作用造成土壤中砷的釋放．在外加硫體系中，溶解態(tài)的As(Ⅲ)和As(T)較無外加硫體系均明顯降低，其中20～40cm深度土壤As(Ⅲ)和As(T)分別降低了499.6μg•L－1和676.2μg•L－1，降低幅度最大，而在60cm以下深度土壤的培養(yǎng)組中，砷的釋放量變化都不大，As(Ⅲ)和As(T)釋放大約減少300μg•L－1和160μg•L－1，說明土壤中微生物的數(shù)量和活性強(qiáng)烈的影響體系中硫酸鹽的還原過程以及砷的環(huán)境行為．與深層土相比，表層土中的微生物在數(shù)量和活性都占有優(yōu)勢(shì)，表土中補(bǔ)加硫酸鹽后明顯抑制了砷的釋放行為．體系中補(bǔ)充適量的硫酸鹽可以大大抑制了砷的釋放行為，在硫酸鹽微生物作用下體系中硫酸鹽還原產(chǎn)物-硫離子可通過產(chǎn)生鐵的硫化物以吸附或共沉淀方式重新固定被釋放的砷，或者直接產(chǎn)生砷的硫化物沉淀，使被釋放的砷再次被固化，回到固相中．從圖1可以看出非生物對(duì)照組中也有部分溶解態(tài)砷釋放，但大多以As(Ⅴ)形式存在，幾乎沒有As(Ⅲ)釋放，只有無硫培養(yǎng)體系中少量的As(Ⅲ)，可能是原有土壤中存在的少量As(Ⅲ)被釋放出來．這可能由于培養(yǎng)基中的乳酸鹽對(duì)砷具有一定的解吸附作用，—COOH與As(Ⅴ)競(jìng)爭吸附后位點(diǎn)，造成砷有一定量的釋放［24］．盡管培養(yǎng)液本身也可引起固相少量的砷溶解，但土壤微生物作用是造成砷的還原與釋放的根本因素.

2.2微生物作用下鹽酸可提取態(tài)砷的形態(tài)分析

砷在土壤中的結(jié)合形態(tài)決定砷的環(huán)境效應(yīng)和生物有效性．鹽酸可提取的砷形態(tài)主要指鹽酸可以溶解的無定形鐵錳氧化物、部分結(jié)晶度很差的結(jié)晶態(tài)鐵氧化物結(jié)合的砷以及酸揮發(fā)硫吸附或共沉淀的砷［25］．圖2給出了在微生物作用下不同土層固相中鹽酸可提取態(tài)As的形態(tài)與含量情況．從圖2中可以看出，與對(duì)照培養(yǎng)組相比無論培養(yǎng)體系中是否外加硫酸鹽，每層土中鹽酸可提取的砷總量都大大降低，而且固相中鹽酸提取的As(T)幾乎全部轉(zhuǎn)化為As(Ⅲ)．其中在沒有外加硫源的體系中，0～20cm表土的培養(yǎng)組中固相中鹽酸提取態(tài)的砷中As(Ⅲ)升高了約2.2mg•kg－1，但鹽酸可提取的As(T)大大減少，As(T)約減少了9.9mg•kg－1．隨著深度增加，鹽酸提取態(tài)As(Ⅲ)和As(T)略有增加．與未加硫的培養(yǎng)體系相比，在外加硫酸鹽的培養(yǎng)體系中經(jīng)過微生物還原后無論是表層土壤還是深層土壤中鹽酸可提取的總砷量均進(jìn)一步降低，其中表土0～20cm鹽酸可提取態(tài)As(T)約為1.5mg•kg－1，與不加硫的體系相比約降低了50%，約占非生物對(duì)照組鹽酸可提取砷總量的11.4%，而加硫與未加硫的非生物對(duì)照組相比變化不大．由表2中數(shù)據(jù)可以看出，與未加硫的體系相比加硫體系中液相被釋放的砷和固相中鹽酸可提取的As(T)的量都大大降低，液相中砷和固相鹽酸提取的砷總量減少了16.5%，相當(dāng)于不加硫生物培養(yǎng)組中釋放的砷和鹽酸可提取砷總量的37.1%轉(zhuǎn)化為鹽酸不可提取的形態(tài)，可見在不加硫條件下，微生物還原作用造成了砷被還原、活化和釋放，而外源硫的加入促使微生物還原/活化的砷轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的形態(tài)．在前期研究中發(fā)現(xiàn)微生物的還原作用可以將砷轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的礦物形式固定下來，如砷還原菌Desulfotomaculumauripigmentum能夠?qū)Ⅲw系中的As(Ⅴ)和硫酸鹽同時(shí)還原形成As2S3沉淀，因此增加砷的穩(wěn)定性［26］．而Kirk等［27］的研究也發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌可通過生成硫化物固持砷．同時(shí)在長期的培養(yǎng)過程中新生的和老化的硫化亞鐵或者次生的黃鐵礦等都是具有較強(qiáng)的固砷能力［28，29］．因此，砷的形態(tài)可伴隨著體系中其它元素的形態(tài)轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化，在本研究中也發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原過程促進(jìn)砷轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的鹽酸不可提取態(tài)，可能與新生的礦物黃鐵礦相結(jié)合，或者被轉(zhuǎn)化為砷的硫化物．

2.3微生物作用下鐵的形態(tài)轉(zhuǎn)化

在本研究中，微生物的還原作用不僅引起砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化，同時(shí)微生物作用下鐵的還原和釋放，以及相伴隨的硫酸鹽還原過程強(qiáng)烈的影響著砷的環(huán)境行為．圖3給出了微生物作用下鐵的形態(tài)轉(zhuǎn)化，并采用鹽酸提取土壤中的無定形鐵氧化物和弱結(jié)晶度的結(jié)晶態(tài)鐵氧化物以及酸揮發(fā)性硫化物中的鐵，研究固相中鐵的形態(tài)轉(zhuǎn)化與砷的環(huán)境行為的關(guān)聯(lián)．由圖3可知，未加外源硫的培養(yǎng)體系中，各層土壤鐵的釋放量有所不同，大部分釋放的鐵都以還原態(tài)的Fe(Ⅱ)形式存在，而非生物對(duì)照組中幾乎沒有溶解態(tài)Fe(Ⅱ)存在，可見體系中微生物還原作用引起了土壤礦物中鐵的還原性溶解．在微生物作用下固相中鹽酸可提取的總鐵量大大增加，其中在表層0～20cm土壤鹽酸提取態(tài)的Fe(Ⅱ)和Fe(T)分別增加了約4956.0mg•kg－1和2248.0mg•kg－1，還原態(tài)的亞鐵離子約占鹽酸可提取態(tài)總鐵的50%．而且與非生物對(duì)照組相比較各層土壤中鹽酸提取態(tài)總鐵的量大約都增加了30%，說明微生物的作用造成土壤固相中的鐵的活化．當(dāng)外加硫酸鹽后，體系中溶解態(tài)的亞鐵離子大大降低．與不添加硫酸鹽的培養(yǎng)組相比，表層0～20cm土壤的培養(yǎng)組溶解態(tài)的Fe(Ⅱ)從40.0mg•L－1降低到0.4mg•L－1，深層60～80cm土培養(yǎng)組中溶解態(tài)Fe(Ⅱ)從50.1mg•L－1降低到1.1mg•L－1．可見添加硫酸鹽后液相中亞鐵離子的釋放過程大大降低，微生物作用下的還原產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)與硫酸鹽的還原產(chǎn)生的硫離子結(jié)合沉淀進(jìn)入固相．在微生物作用下培養(yǎng)8d后無論哪一層土中鹽酸可提取的總鐵量進(jìn)一步大大增加，是非生物對(duì)照組鹽酸可提取鐵量的2～3倍．同時(shí)，添加與未添加硫酸鹽的培養(yǎng)組相比，表層0～20cm土中鹽酸可提取的總鐵含量增加最多，從9036.0mg•kg－1增加到15996.7mg•kg－1．這部分亞鐵的增長主要是來自于液相中被硫離子沉淀下來的Fe(Ⅱ)，說明通過添加硫酸鹽可以促進(jìn)體系中被釋放的鐵的再固定過程，減少固相的鐵流失．固相中鹽酸提取的亞鐵離子中可能包括土壤中原有的極少量亞鐵礦物中的亞鐵，微生物直接催化鐵還原產(chǎn)生的亞鐵離子與體系中硫酸鹽的還原產(chǎn)物硫化氫發(fā)生沉淀而固定下來的亞鐵，以及硫化氫所參與固相中鐵的還原產(chǎn)生的亞鐵［30］．本研究中培養(yǎng)8d后的體系中，無硫體系中硫離子(濃度約為335.3μg•L－1)與亞鐵離子的離子積KIAP(約為7.6×10－9)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于硫化亞鐵的容度積Ksp(約為1.59×10－19)．因此可以確定體系中產(chǎn)生了硫化亞鐵，砷可以被新生的硫化亞鐵以吸附、包裹、沉淀或共沉淀等途徑固持．不過從鹽酸可提取的總鐵數(shù)據(jù)中可以看出，亞鐵所占的比例大約在50%左右，體系中還有較多高鐵礦物，體系中還原產(chǎn)生的亞鐵離子可以再次被吸附到鐵氧化物表面，因此體系中應(yīng)存在部分的Fe3O4，新生的Fe3O4也可以結(jié)合部分的砷．一些學(xué)者研究認(rèn)為［28，29］，新生的硫化亞鐵礦物在培養(yǎng)過程中會(huì)逐漸老化生成黃鐵礦(FeS2)，作為鹽酸不可提取的形態(tài)之一，黃鐵礦所固定的砷的形態(tài)更加穩(wěn)定．不過硫化亞鐵向黃鐵礦轉(zhuǎn)化過程比較慢，在本研究培養(yǎng)的8d內(nèi)即使形成了黃鐵礦，它的比例也非常低，因此在鹽酸不能提取的砷中，黃鐵礦結(jié)合的砷不會(huì)是主要形態(tài)，這部分砷的賦存形態(tài)很可能是主要以硫化物的形式存在．

2.4微生物作用下硫酸鹽還原與砷、鐵的環(huán)境行為的關(guān)聯(lián)

在天然混合微生物群的作用下，除了發(fā)生砷酸鹽還原過程外，通常也伴隨著鐵和硫的還原過程．硫酸鹽還原作用下產(chǎn)生的硫化氫可與體系中產(chǎn)生的亞鐵離子或亞砷酸鹽離子相結(jié)合，產(chǎn)生鐵的硫化物或砷的硫化物．形成硫化亞鐵沉淀時(shí)可以同時(shí)沉淀或共沉淀體系中釋放的砷酸鹽和亞砷酸鹽．這一過程在地下水或河流沉積物中多有發(fā)生，因此硫化亞鐵等酸揮發(fā)硫化物對(duì)固持重金屬離子具有很重要的作用［31，32］．本研究采用鹽酸提取酸揮發(fā)性的硫化物，研究硫化物與砷的環(huán)境行為的關(guān)聯(lián)．圖4給出了在缺氧培養(yǎng)的8d內(nèi)體系中硫酸鹽的還原與硫化物的產(chǎn)量變化情況．從圖4可以看出，不同土層酸揮發(fā)硫的產(chǎn)量有所不同．可能由于表層土壤中有機(jī)質(zhì)含量較高，因此無論是否外加硫酸鹽表土0～20cm土的培養(yǎng)組中AVS產(chǎn)量總是比其他土壤層的產(chǎn)量高很多．在未加硫酸鹽的培養(yǎng)體系中，酸揮發(fā)硫的產(chǎn)量都在2.5mg•kg－1以下，在外加10mmol•L－1的硫酸鹽后每層土壤的培養(yǎng)物中鹽酸AVS的量都超過200mg•kg－1．對(duì)于其他幾層的土壤而言，外加的硫酸鹽也大大促進(jìn)了體系中硫化物的產(chǎn)量．圖4與圖2和圖3比較可以看出，鹽酸提取態(tài)的Fe(Ⅱ)與各土層AVS變化趨勢(shì)成正相關(guān)，硫化亞鐵是固相中鹽酸可提取的亞鐵離子的主要以形態(tài)．而在酸揮發(fā)硫或者說硫化亞鐵含量較高的培養(yǎng)組中鹽酸可提取的砷的量較低，二者呈負(fù)相關(guān)．體系產(chǎn)生的酸揮發(fā)硫越多，砷的釋放越少．可見土壤中原有的硫酸鹽含量不足，當(dāng)外源提供足夠的硫酸鹽條件下微生物的作用硫酸鹽還原更見明顯，可以在很大程度上促進(jìn)砷的固定．特別是微生物豐富的表層土中，加硫培養(yǎng)促進(jìn)了體系中釋放的和鹽酸提取態(tài)的砷大大降低，以降低的總量計(jì)算相當(dāng)于無硫體系中釋放的和鹽酸可提取的砷總和的37.1%的砷再次被轉(zhuǎn)化為鹽酸不能提取的穩(wěn)定的形態(tài)．體系中硫離子和亞砷酸鹽在液相中的濃度及其離子濃度積，可作為判斷產(chǎn)生硫化物的依據(jù)．例如在表土0～20cm的不加硫的生物培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)8d后體系中硫離子與三價(jià)砷的平衡濃度分別為335.3μg•L－1和562.2μg•L－1，而加硫的體系中硫離子與三價(jià)砷的平衡濃度69.85mg•L－1和318.9μg•L－1，根據(jù)液相中S－2及As(Ⅲ)的平衡濃度進(jìn)行估算，不加硫系統(tǒng)的lgKIAP約為－25.2，加硫體系中l(wèi)gKIAP-S約為－18.7，無論那個(gè)體系培養(yǎng)8d后三價(jià)砷及硫離子的離子積的lgKIAP都大于lgKSP(約為－46.22［33］，其中KIAP表示液相中三價(jià)砷與硫離子的離子積，KSP表示As2S3的容度積)，說明無論是否補(bǔ)加硫酸鹽，體系中產(chǎn)生了As2S3沉淀．不過由于土壤中礦物成分太復(fù)雜，新生礦物的含量相對(duì)較低，目前還沒有更直接的光波譜數(shù)據(jù)加以證實(shí)，這部分仍有進(jìn)行待進(jìn)一步的表征和研究．

3結(jié)論

(1)在張士污灌區(qū)的土壤中，土著微生物具有較強(qiáng)的砷、鐵和硫的還原能力．(2)微生物對(duì)鐵和硫的還原作用及其還原產(chǎn)物共同調(diào)控砷的環(huán)境行為，在不加硫條件下，微生物對(duì)鐵氧化物的還原性溶解造成了砷的活化和釋放，補(bǔ)加硫酸鹽可以抑制砷的釋放過程，使已活化的砷再次被固持．(3)在硫酸鹽還原作用下形成非常穩(wěn)定的硫化物礦物As2S3是土壤微生物固定砷的主要途徑．